Recuperación de aromas mediante
sistemas de extracción de
dos fases acuosas
Marco Rito Palomares
Los aromas y fragancias usados en las industrias de alimentos, cosméticos y de detergentes son productos de gran significado comercial. Tanto los aromas como las fragancias son compuestos volátiles; la diferencia radica en que las fragancias se respiran, mientras que los aromas se ingieren y tienen su principal aplicación en la industria alimentaria y farmacéutica. Lo anterior implica la consideración de normas rigurosas. En este contexto, los procesos tradicionales de síntesis química para la producción de aromas involucran un excesivo número de etapas de proceso y la mayoría de ellos son altamente contaminantes. Dicha situación demanda el uso de técnicas alternativas para la producción de estos compuestos. La producción de aromas mediante el uso de microorganismos ha definido una tecnología alternativa a la química para la obtención de estos productos.
Un caso interesante es la producción de lactonas por hongos, en particular la producción de una lactona con aroma a coco (6-pentil-alfa-pirona; 6PP) por especies de Trichoderma, cuya biosíntesis ha sido previamente estudiada. En este tipo de procesos biotecnológicos es importante considerar que las bajas concentraciones de los productos de interés en el caldo de concentración en donde se cultivan presentan problemas en las subsecuentes operaciones unitarias de recuperación o “downstream processing”. Además, en diversos procesos de fermentación, al producirse el metabolito de interés, éste puede provocar la inhibición de su propia síntesis. Tal es el caso de la 6PP, de la cual se ha reportado un efecto fungicida sobre diversos hongos e inclusive sobre la misma cepa de Trichoderma. Esto último es importante para los estudios en los que se busca mejorar la productividad del proceso.
Dentro de las alternativas biotecnológicas, los procesos de fermentación extractiva o recuperación in situ pueden ser utilizados para recuperar el aroma del caldo de fermentación a medida que es producido y al mismo tiempo desintoxicar el medio de cultivo, lo que permite una mejora en la eficiencia de la biosíntesis. En el caso particular de la 6PP, varios intentos basados en el uso de técnicas biotecnológicas se han reportado para la recuperación del aroma. Algunos de ellos incluyen: el uso de adsorbentes lipofílicos (Amberlita XAD-2), pervaporación de la molécula a través de membranas hidrofóbicas e inmovilización de la cepa Trichoderma. Sin embargo, una fuerte desventaja de estos sistemas radica en su complejidad, costo y efectos negativos sobre la cepa. Por ejemplo, en el caso de la inmovilización, es evidente una disminución en la producción de 6PP comparada con la del sistema soluble.
Como consecuencia, los métodos basados en evaporación del producto, tamaño de partícula e inmovilización de células se han descartado como una alternativa viable debido a los efectos sobre el producto, problemas con membranas y bajos rendimientos.
En este contexto, la extracción líquido-líquido utilizando solventes se ha desarrollado para la recuperación de compuestos volátiles, y se presenta como una alternativa a los problemas de complejidad encontrados en otros métodos de extracción. Desafortunadamente, el problema principal de este método radica en las características del solvente utilizado, y es la toxicidad hacia los microorganismos uno de los más importantes. Una metodología no convencional que se presenta para minimizar los problemas típicos de la extracción con solventes es la extracción basada en el uso de sistemas de dos fases acuosas.
Los sistemas de dos fases acuosas se forman al mezclar dos polímeros (ej. polietilen-glicol (PEG) y dextrano), o bien, un polímero y una sal (PEG y fosfato) a ciertas concentraciones. La aplicación de esta técnica a la fermentación extractiva de productos se puede realizar agregando polímeros (o polímero y sal) al caldo de fermentación hasta formar dos fases. Los microorganismos permanecerán en una fase (idealmente la fase pesada) y los compuestos de bajo peso molecular se distribuirán entre las fases. Una de las primeras extracciones basadas en esta metodología fue la de toxinas generadas por Clostridium tetani. En este caso, las células permanecieron en la fase pesada rica en el polímero (dextrano, en este caso), mientras que la toxina se distribuyó entre las fases. Como resultado, un aumento en la producción de la toxina fue reportado.
Algunas ventajas adicionales de esta tecnología son su biocompatibilidad con macromoléculas, su facilidad de aplicación a gran escala y bajo costo así como su bajo efecto sobre el crecimiento microbiano, entre otras. Además, ciertos parámetros, como la relación de volúmenes de las fases, son manipulados a fin de concentrar el producto de interés en una de las fases (idealmente la ligera) de donde puede ser recuperado posteriormente por métodos convencionales, o bien, por otro sistema de dos fases acuosas.
Los sistemas de dos fases acuosas han sido utilizados para la recuperación de productos proteicos a partir de suspensiones biológicas. En el área de fermentación extractiva (o recuperación in situ) existen también ciertos intentos reportados para la recuperación del mismo tipo de productos. Sin embargo, no existen reportes que discutan el uso de esta tecnología en cultivos con hongos y más aun, para la recuperación de aromas producidos por este tipo de cultivos filamentosos.
En el Centro de Biotecnología del Campus Monterrey durante 18 meses se desarrolló un proyecto sobre la recuperación de aromas producidos por hongos en colaboración con el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y con financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). El objetivo fue evaluar el comportamiento de 6PP y el sistema de fermentación en sistemas de dos fases acuosas. Un segundo objetivo fue la definición de las condiciones de operación para el proceso de recuperación in situ del aroma 6PP que minimiza el efecto de inhibición del aroma sobre el microorganismo y permite aumentar la productividad del proceso. Este tipo de investigación representa la aplicación del estado del arte en procesos de bioseparación en la solución de problemas de inhibición observados en procesos de fermentación de hongos filamentosos. En este estudio en particular se seleccionó un sistema modelo formado por la producción de 6PP por Trichoderma harzianum. Este sistema cumple con ciertas características, tales como problemas de agitación, producción de aromas e inhibición por producto, por lo que se considera un ejemplo representativo.
Metodología
El procedimiento necesario para la obtención de las condiciones de operación del proceso de recuperación de 6PP involucró como primera etapa, evaluar el comportamiento del sistema de fermentación en los sistemas de dos fases acuosas. La partición del aroma (6PP) y del microorganismo (Trichoderma harzianum) en los sistemas de dos fases acuosas se evaluó utilizando sistemas experimentales a nivel laboratorio. Los sistemas de dos fases acuosas utilizados fueron caracterizados por el uso de poli-etilen-glicol (PEG) de diferentes pesos moleculares (1000, 1450, 3350 y 8000 daltons), fosfato y el caldo de fermentación que contenía el aroma. La disolución de los compuestos se logró mediante agitación mecánica por 30 minutos a 25ēC. La separación de las fases fue alcanzada por centrifugación a 1500 g. por 20 minutos a 25ēC. Con el objeto de caracterizar los sistemas, se tomaron muestras de las fases para estimar el contenido de aroma y biomasa en cada una de ellas, utilizando cromatografía de gases y la técnica de peso seco, respectivamente. Estos resultados fueron utilizados para estimar el coeficiente de partición de los solutos (K = concentración del soluto en la fase ligera / concentración del soluto en la fase pesada), el porcentaje de recuperación del aroma y el de eliminación de contaminantes (biomasa). Con el uso de esta metodología fue posible evaluar diversas condiciones de operación para la recuperación de 6PP del caldo de fermentación de Trichoderma harzianum.
Resultados
Se evaluó el comportamiento de 6PP producido por Trichoderma harzianum en sistemas de dos fases acuosas (PEG fosfato), bajo diversas condiciones de operación: peso molecular de PEG, concentración de PEG, concentración de fosfato, relación de volumen de las fases, etcétera. Se encontraron las condiciones de operación (PEG 1450, relación de volumen menor a 0.3, concentración de los compuestos menor a 15%) bajo las cuales 6PP y Trichoderma harzianum se concentran en fases opuestas. Es importante resaltar que dichas condiciones permiten disminuir el efecto de inhibición de 6PP sobre el microorganismo porque a medida que el aroma se produce, se concentra en una fase (fase extractiva) opuesta a la fase (fase fermentativa) en la cual se concentra Trichoderma harzianum. En general, los sistemas evaluados en este estudio permitieron concentrar más del 85% de biomasa en la fase fermentativa y más del 75% de 6PP en la fase extractiva.
El uso de sistemas de dos fases acuosas para la recuperación de compuestos no proteicos y, en particular, para la recuperación de aromas fue por primera vez investigado y reportado como resultado de este estudio. Las condiciones de operación del proceso de recuperación del aroma obtenidas a nivel laboratorio (15 50 mL) fueron aplicadas a niveles de fermentación de hasta 7 litros, y como resultado se obtuvo un aumento en la productividad del sistema cercana al 25%. Los resultados obtenidos han demostrado la factibilidad técnica del proceso. Es claro que los resultados de este proyecto permiten descubrir el potencial de aplicación de los sistemas de extracción de dos fases acuosas para la recuperación de productos biotecnológicos y, en particular, aromas.
En conclusión, el uso de la técnica no convencional de extracción que explota los sistemas de dos fases acuosas presenta una alternativa tecnológica para la recuperación de aromas de fermentación miceliares (hongos) que evita los problemas de toxicidad presentes en ciertos sistemas de fermentación. En particular, se demostró el potencial técnico de recuperar 6PP producido por Trichoderma harzianum como una alternativa a los sistemas de extracción evaluados y reportados hasta el momento. El uso de esta técnica de extracción potencialmente puede reducir los problemas de toxicidad presentes en ciertos sistemas de fermentación. Como resultado del presente estudio, la aplicación de sistemas de dos fases acuosas para la recuperación de aromas (6PP) fue por primera vez reportada a la comunidad científica.
Marco Rito Palomares obtuvo el Doctorado en Ingeniería Química y Biotecnología de University of Birmingham, del Reino Unido en 1995. Es profesor del Centro de Biotecnología y profesor adscrito del Departamento de Ingeniería Química.
Transferencia Posgrado, Investigación y Extensión en el Campus Monterrey
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de investigación, extensión y posgrado.